Pemisahan Asam Amino dengan Elektroforesis (Prinsip, Teknik, dan Aplikasi)

Elektroforesis adalah teknik pemisahan campuran molekul bermuatan berdasarkan perbedaan laju migrasinya dalam medan listrik. Dalam konteks asam amino, teknik ini memanfaatkan sifat amfoter asam amino, yaitu kemampuannya untuk bermuatan positif, negatif, atau netral, bergantung pada pH larutan di sekitarnya.

Pemahaman mendalam tentang elektroforesis asam amino memerlukan penguasaan konsep kesetimbangan asam-basa, titik isoelektrik (pI), dan perilaku ion zwitter. Teknik ini menjadi fondasi bagi berbagai metode analisis biokimia modern, mulai dari pemisahan protein hingga sekuensing DNA.

Relevansi OSN Kimia: Soal elektroforesis asam amino kerap muncul dalam OSN Kimia hingga level internasional (IChO). Konsep yang diuji meliputi: perhitungan pI, prediksi arah migrasi pada pH tertentu, dan penentuan komposisi campuran berdasarkan pola pemisahan.

---

1. Tinjauan Struktur dan Sifat Asam Amino

1.1 Struktur Umum Asam Amino

Setiap asam amino memiliki struktur inti yang terdiri atas atom karbon alfa (\(\alpha\)-C) yang terhubung dengan empat gugus: gugus amino (\(-NH_2\)), gugus karboksil (\(-COOH\)), atom hidrogen (\(-H\)), dan gugus samping atau rantai R yang bersifat khas untuk setiap asam amino.

Struktur umum asam amino (bentuk molekul tak terion)

1.2 Sifat Amfoter dan Zwitterion

Asam amino bersifat amfoter: dapat bertindak sebagai asam (donor proton) maupun basa (akseptor proton). Dalam larutan air, asam amino lebih stabil dalam bentuk zwitterion (ion dwipolar), di mana gugus amino telah menerima proton menjadi \(-NH_3^+\) dan gugus karboksil telah melepas proton menjadi \(-COO^-\).

Gambar 1. Kesetimbangan ionisasi asam amino sebagai fungsi pH

1.3 Konstanta Ionisasi dan pKa

Ionisasi asam amino berlangsung secara bertahap. Untuk asam amino sederhana (gugus R tidak terionisasi), terdapat dua konstanta asam yang relevan:

• pKa1: konstanta ionisasi gugus karboksil (\(-COOH \rightleftharpoons -COO^- + H^+\)), umumnya bernilai 1,8 - 2,4
• pKa2: konstanta ionisasi gugus ammonium (\(-NH_3^+ \rightleftharpoons -NH_2 + H^+\)), umumnya bernilai 8,8 - 10,8

Untuk asam amino dengan gugus R yang dapat terionisasi (misalnya asam glutamat, lisin, histidin), terdapat konstanta ketiga pKaR yang mencerminkan ionisasi gugus samping.

Asam Amino	pKa1 (COOH)	pKa2 (NH3+)	pKaR (R)	pI
Glisin (Gly)	2,35	9,78	-	6,07
Alanin (Ala)	2,35	9,87	-	6,11
Serin (Ser)	2,19	9,21	-	5,70
Asam Aspartat (Asp)	1,99	9,90	3,90 (COOH)	2,85
Asam Glutamat (Glu)	2,10	9,47	4,07 (COOH)	3,15
Lisin (Lys)	2,16	9,06	10,54 (NH3+)	9,60
Arginin (Arg)	1,82	8,99	12,48 (guanidinium)	10,76
Histidin (His)	1,80	9,33	6,04 (imidazol)	7,59
Sistein (Cys)	1,92	10,70	8,37 (SH)	5,07
Tirosin (Tyr)	2,20	9,11	10,07 (OH)	5,66

Tabel 1. Nilai pKa dan pI beberapa asam amino penting

---

2. Titik Isoelektrik (pI)

2.1 Definisi

Titik isoelektrik (pI) adalah nilai pH di mana asam amino berada dalam bentuk zwitterion dan muatan netto-nya adalah nol. Pada pH ini, asam amino tidak akan bermigrasi dalam medan listrik.

2.2 Perhitungan pI

Cara menghitung pI bergantung pada jumlah gugus yang dapat terionisasi pada asam amino tersebut.

Asam amino dengan dua gugus terionisasi (pKa1 dan pKa2)

Untuk asam amino netral (glisin, alanin, dsb.), pI merupakan rata-rata aritmetik dari dua nilai pKa yang mengapit bentuk zwitterion:

$$\text{pI} = \frac{\text{p}K_{a1} + \text{p}K_{a2}}{2}$$

Contoh, Glisin:

$$\text{pI}_{\text{Gly}} = \frac{2{,}35 + 9{,}78}{2} = 6{,}07$$

Asam amino dengan gugus R asam (pKaR kecil)

Untuk asam amino asam seperti asam aspartat dan asam glutamat, zwitterion berada di antara pKa1 dan pKaR (keduanya adalah gugus karboksil). Gugus pKa2 (\(-NH_3^+\)) jauh lebih besar sehingga tidak relevan:

$$\text{pI} = \frac{\text{p}K_{a1} + \text{p}K_{aR}}{2}$$

Contoh, Asam Aspartat:

$$\text{pI}_{\text{Asp}} = \frac{1{,}99 + 3{,}90}{2} = 2{,}85$$

Asam amino dengan gugus R basa (pKaR besar)

Untuk asam amino basa seperti lisin dan arginin, zwitterion berada di antara pKa2 dan pKaR (keduanya adalah gugus bernitrogen). Gugus pKa1 (\(-COOH\)) jauh lebih kecil sehingga tidak relevan:

$$\text{pI} = \frac{\text{p}K_{a2} + \text{p}K_{aR}}{2}$$

Contoh, Lisin:

$$\text{pI}_{\text{Lys}} = \frac{9{,}06 + 10{,}54}{2} = 9{,}80$$

Aturan umum memilih pasangan pKa untuk pI: Identifikasi bentuk zwitterion (muatan bersih = 0), lalu ambil pKa dari spesi di kiri dan di kanan zwitterion dalam diagram ionisasi. Nilai pI adalah rata-rata kedua pKa tersebut.

2.3 Diagram Spesi Ionik sebagai Fungsi pH

Dengan menggunakan persamaan Henderson-Hasselbalch, fraksi masing-masing spesi ionik dapat dihitung pada berbagai pH. Kurva distribusi spesi ini penting untuk memahami mengapa asam amino bermigrasi ke arah tertentu dalam medan listrik.

$$\text{pH} = \text{p}K_a + \log\frac{[\text{A}^-]}{[\text{HA}]}$$

---

3. Prinsip Elektroforesis Asam Amino

3.1 Dasar Pemisahan

Ketika campuran asam amino ditempatkan pada media elektroforesis (kertas, gel, atau larutan) dan dialiri arus listrik searah, masing-masing asam amino akan bermigrasi sesuai dengan muatan netto-nya pada pH medium:

• Asam amino bermuatan positif (pH medium < pI): bermigrasi menuju katoda (kutub negatif)
• Asam amino bermuatan negatif (pH medium > pI): bermigrasi menuju anoda (kutub positif)
• Asam amino netral (pH medium = pI): tidak bermigrasi

Gambar 2. Skema elektroforesis campuran Lys, Gly, dan Asp pada pH ~ 6. Lys bermuatan positif bergerak ke katoda; Asp bermuatan negatif bergerak ke anoda; Gly hampir tidak bergerak.

3.2 Faktor yang Mempengaruhi Laju Migrasi

Laju migrasi suatu asam amino (\(\mu\)) dalam medan listrik ditentukan oleh beberapa faktor yang saling berinteraksi:

$$\mu = \frac{q}{6\pi\eta r}$$

di mana \(q\) adalah muatan netto ion, \(\eta\) adalah viskositas medium, dan \(r\) adalah jari-jari hidrodinamik molekul. Secara kualitatif, faktor-faktor berikut menentukan pemisahan:

• Muatan netto: semakin besar selisih antara pH medium dan pI, semakin besar muatan netto, semakin cepat migrasi.
• Ukuran dan massa molekul: molekul yang lebih kecil bermigrasi lebih cepat (terutama relevan dalam gel elektroforesis di mana ada efek pengayakan molekul).
• Kuat medan listrik: tegangan yang lebih tinggi meningkatkan laju migrasi semua spesi secara proporsional.
• Viskositas medium: viskositas yang lebih rendah mempercepat migrasi.
• pH buffer: menentukan muatan netto setiap asam amino. Pemilihan pH buffer adalah kunci keberhasilan pemisahan.
• Suhu: suhu lebih tinggi menurunkan viskositas tetapi juga dapat menyebabkan denaturasi protein pada aplikasi biokimia.

3.3 Menentukan Muatan Netto pada pH Tertentu

Muatan netto suatu asam amino pada pH tertentu dapat diperkirakan secara kuantitatif dengan menggunakan persamaan Henderson-Hasselbalch untuk setiap gugus yang terionisasi. Prosedur umumnya:

1. Tuliskan semua gugus terionisasi beserta nilai pKa-nya, urutkan dari yang terkecil.
2. Tentukan fraksi terdeprotonasi (\(f_{A^-}\)) untuk setiap gugus pada pH yang diberikan menggunakan: $$f_{A^-} = \frac{1}{1 + 10^{(\text{p}K_a - \text{pH})}}$$
3. Jumlahkan kontribusi muatan setiap gugus:
   • Gugus yang terdeprotonasi dari bentuk bermuatan positif (misalnya \(-NH_3^+ \to -NH_2\)): kontribusi berubah dari +1 ke 0.
   • Gugus yang terdeprotonasi dari bentuk netral (misalnya \(-COOH \to -COO^-\)): kontribusi berubah dari 0 ke -1.
4. Hitung muatan netto total.

Contoh Muatan netto Glisin pada pH 6,07 (= pI):

Glisin memiliki pKa1 = 2,35 (gugus COOH) dan pKa2 = 9,78 (gugus NH3+).

$$f_{COO^-} = \frac{1}{1 + 10^{(2{,}35 - 6{,}07)}} = \frac{1}{1 + 10^{-3{,}72}} \approx 1{,}000$$ $$f_{NH_2} = \frac{1}{1 + 10^{(9{,}78 - 6{,}07)}} = \frac{1}{1 + 10^{3{,}71}} \approx 0{,}000$$

Sehingga muatan netto:

$$Z = (+1)(1 - f_{NH_2}) + (-1)(f_{COO^-}) = (+1)(1{,}000) + (-1)(1{,}000) = 0$$

Hasilnya konsisten dengan definisi pI: muatan netto = 0 pada pH = pI.

---

4. Metode Elektroforesis Asam Amino

4.1 Elektroforesis Kertas (Paper Electrophoresis)

Dalam elektroforesis kertas, strip kertas saring dibasahi dengan larutan buffer pada pH tertentu. Sampel asam amino diteteskan di tengah strip, kemudian arus listrik dialirkan selama beberapa jam. Setelah proses selesai, kertas dikeringkan dan divisualisasi dengan pewarna seperti ninhidrin yang menghasilkan warna ungu (Reaksi Ruhemann) dengan asam amino primer (biru-ungu) dan sekunder seperti prolin (kuning-jingga).

Metode ini sederhana, murah, dan cocok untuk pemisahan asam amino bebas. Resolusinya lebih rendah dibandingkan metode gel.

4.2 Elektroforesis Gel Poliakrilamida (PAGE)

Gel poliakrilamida memiliki jaringan pori berukuran molekuler yang memberikan efek pengayakan ukuran (size sieving). Molekul yang lebih kecil bermigrasi lebih cepat melalui matriks gel, sehingga pemisahan terjadi berdasarkan kombinasi muatan netto DAN ukuran molekul.

Pada SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-PAGE), detergen SDS ditambahkan untuk mendenaturasi protein dan melapisinya dengan muatan negatif seragam, sehingga pemisahan murni didasarkan pada ukuran. Namun untuk asam amino bebas (bukan protein), PAGE tanpa SDS lebih relevan.

4.3 Isoelectric Focusing (IEF)

Isoelectric Focusing adalah teknik elektroforesis paling presisi untuk pemisahan asam amino dan protein. Dalam IEF:

1. Dibuat gradien pH di sepanjang medium pemisahan (menggunakan ampholit, campuran buffer amfoter sintetis).
2. Molekul bermigrasi dalam medan listrik hingga mencapai posisi di mana pH = pI-nya.
3. Pada titik tersebut, muatan netto menjadi nol dan migrasi berhenti. Molekul terfokus pada pita sempit.

IEF menghasilkan resolusi yang sangat tinggi; bahkan molekul yang hanya berbeda 0,01 unit pI dapat dipisahkan. Teknik ini menjadi dasar dimensi pertama pada elektroforesis dua dimensi (2D-PAGE).

Gambar 3. Prinsip Isoelectric Focusing (IEF): setiap asam amino berfokus pada posisi di mana pH gradien = pI-nya

---

5. Pemilihan pH Buffer dan Strategi Pemisahan

5.1 Pemilihan pH Buffer yang Optimal

Kunci keberhasilan elektroforesis asam amino adalah pemilihan pH buffer yang tepat. Prinsipnya:

• Pilih pH yang memaksimalkan perbedaan muatan netto antarspesi yang ingin dipisahkan.
• Hindari pH yang sama dengan pI salah satu spesi jika spesi lain juga tidak bermigrasi jauh.
• Gunakan buffer dengan kapasitas penyangga yang memadai pada rentang pH operasi.

Contoh strategi: Untuk memisahkan campuran Gly (pI 6,07), Lys (pI 9,60), dan Asp (pI 2,85), pilih pH 6,07 (= pI Gly). Pada pH ini, Lys bermuatan positif dan bergerak ke katoda, Asp bermuatan negatif dan bergerak ke anoda, sedangkan Gly tidak bermigrasi. Pemisahan menjadi sangat efektif.

5.2 Buffer yang Umum Digunakan

Buffer	Rentang pH efektif	Aplikasi umum
Asetat (CH3COOH/CH3COONa)	3,8 - 5,8	Pemisahan asam amino asam
Fosfat (H2PO4-/HPO42-)	5,8 - 8,0	Pemisahan asam amino netral dan campuran
Borat	8,0 - 10,0	Pemisahan asam amino basa
Bikarbonat	6,0 - 8,0	Pemisahan umum
TRIS-HCl	7,0 - 9,0	Biokimia protein dan peptida

5.3 Analisis Kasus: Pemisahan Campuran Kompleks

Pertimbangkan campuran asam amino berikut yang diuji pada tiga nilai pH berbeda:

Asam Amino	pI	Muatan pada pH 3	Muatan pada pH 6	Muatan pada pH 10
Asam Aspartat (Asp)	2,85	~ 0	(−)	(−)
Glisin (Gly)	6,07	(+)	~ 0	(−)
Lisin (Lys)	9,60	(+)	(+)	~ 0

Tabel 2. Prediksi muatan netto pada tiga pH berbeda

Dari tabel di atas, pH 6 adalah kondisi optimal: ketiga asam amino memiliki muatan berbeda (Asp negatif, Gly netral, Lys positif) dan dapat terpisah sepenuhnya dalam satu langkah elektroforesis.

---

6. Perhitungan Kuantitatif Lanjutan

6.1 Muatan Netto Fraksional

Untuk asam amino sederhana (dua gugus terionisasi), muatan netto pada pH sembarang dapat dihitung menggunakan ekspresi berikut. Misalkan \(H_2A^+\) adalah bentuk kation (protonasi penuh), \(HA\) adalah zwitterion, dan \(A^-\) adalah anion:

$$Z = \frac{(+1) \cdot 10^{\text{p}K_{a1} - \text{pH}} - (-1) \cdot 10^{\text{pH} - \text{p}K_{a2}}}{1 + 10^{\text{p}K_{a1} - \text{pH}} + 10^{\text{pH} - \text{p}K_{a2}}}$$

Atau secara lebih umum, dengan mendefinisikan \(\alpha_i\) sebagai fraksi molar spesi ke-i, muatan netto:

$$Z = \sum_i z_i \cdot \alpha_i$$

6.2 Contoh Perhitungan Lengkap

Soal: Hitung muatan netto rata-rata Histidin (pKa1 = 1,80; pKa2 = 9,33; pKaR = 6,04) pada pH 7,40 (pH fisiologis).

Histidin memiliki tiga gugus terionisasi. Bentuk-bentuk ioniknya (dari asam ke basa):

• \(H_3A^{2+}\): COOH, NH3+, imidazolium+. Muatan total = +2
• \(H_2A^+\): COO-, NH3+, imidazolium+. Muatan total = +1
• \(HA\): COO-, NH3+, imidazol. Muatan total = 0 (zwitterion)
• \(A^-\): COO-, NH2, imidazol. Muatan total = -1

Pada pH 7,40:

$$[\text{imidazolium terprotonasi}]: \frac{10^{6{,}04-7{,}40}}{1+10^{6{,}04-7{,}40}} = \frac{10^{-1{,}36}}{1+10^{-1{,}36}} = \frac{0{,}0437}{1{,}0437} = 0{,}0419$$ $$[\text{NH}_3^+\text{ terprotonasi}]: \frac{10^{9{,}33-7{,}40}}{1+10^{9{,}33-7{,}40}} = \frac{10^{1{,}93}}{1+10^{1{,}93}} = \frac{85{,}1}{86{,}1} = 0{,}9884$$ $$[\text{COOH terprotonasi}]: \frac{10^{1{,}80-7{,}40}}{1+10^{1{,}80-7{,}40}} \approx 0{,}000$$

Muatan netto histidin pada pH 7,40:

$$Z = (+1)(0{,}0419) + (+1)(0{,}9884) + (0) \approx -1 + 0{,}0419 + 0{,}9884$$

Dengan mengintegrasikan kontribusi dari semua gugus (setiap gugus bermuatan memberikan kontribusi sesuai fraksi terprotonasi):

$$Z = f_{NH_3^+}(+1) + f_{\text{imH}^+}(+1) + f_{COO^-}(-1) = 0{,}9884 + 0{,}0419 + (-1) = +0{,}031$$

Histidin bermuatan netto sangat kecil positif (+0,031) pada pH 7,40, artinya hampir tidak bermigrasi namun sedikit condong ke katoda. Ini konsisten dengan pI histidin = 7,59 (sedikit di atas pH 7,40).

---

7. Visualisasi dan Deteksi

7.1 Reaksi Ninhidrin

Setelah elektroforesis selesai, posisi asam amino pada kertas atau gel divisualisasi. Ninhidrin adalah reagen yang paling umum digunakan. Ninhidrin bereaksi dengan gugus \(\alpha\)-amino bebas dari asam amino primer menghasilkan produk berwarna ungu-biru (senyawa Ruhemann) yang menyerap kuat pada 570 nm. Prolin dan hidroksiprolin (asam amino sekunder) menghasilkan warna kuning-jingga.

Intensitas warna berbanding lurus dengan konsentrasi asam amino sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif (densitometri).

7.2 Metode Deteksi Lain

• Fluorescamin dan OPA (o-phthalaldehyde): untuk deteksi berfluoresensi dengan sensitivitas lebih tinggi (hingga pikomol).
• Autoradiografi: bila asam amino dilabeli dengan isotop radioaktif (\(^{14}C\), \(^{35}S\)).
• UV absorption: asam amino aromatik (Trp, Tyr, Phe) menyerap pada 280 nm dan 250 nm.
• HPLC pasca-kolom: deteksi derivat asam amino setelah separasi kromatografi.

---

8. Aplikasi Elektroforesis Asam Amino

• Diagnosis klinis: analisis aminoasiduria (kelainan metabolisme asam amino) pada sampel urin dan plasma darah.
• Penelitian biokimia: karakterisasi hidrolisiat protein, studi kinetika metabolisme.
• Industri pangan: kontrol kualitas produk fermentasi dan suplemen asam amino.
• Forensik: identifikasi asam amino dalam artefak biologis.
• Pengembangan obat: karakterisasi peptida dan protein terapeutik.

---

9. Soal Latihan Setara OSN Kimia

Data yang diperlukan tersedia di Tabel 1 pada artikel ini. Gunakan konstanta yang diberikan dalam soal bila berbeda dari tabel.

---

Soal 1: Campuran 3 asam amino

Campuran tiga asam amino, Alanin (pI = 6,11), Asam Glutamat (pI = 3,15), dan Lisin (pI = 9,60), dipisahkan dengan elektroforesis kertas menggunakan buffer fosfat pada pH 6,11.

(a) Tentukan muatan netto dan arah migrasi masing-masing asam amino pada kondisi tersebut.

(b) Urutkan ketiganya dari yang berada paling jauh di sisi katoda hingga paling jauh di sisi anoda setelah proses elektroforesis.

(c) Jelaskan mengapa pH 6,11 dipilih sebagai kondisi optimal untuk memisahkan campuran ini.

Pembahasan:

(a) Analisis muatan netto pada pH 6,11:

• Alanin (pI = 6,11): pH = pI, sehingga muatan netto = 0. Alanin berada sebagai zwitterion dan tidak bermigrasi.
• Asam Glutamat (pI = 3,15): pH (6,11) > pI (3,15), sehingga asam glutamat bermuatan netto negatif. Bermigrasi menuju anoda (+).
• Lisin (pI = 9,60): pH (6,11) < pI (9,60), sehingga lisin bermuatan netto positif. Bermigrasi menuju katoda (-).

(b) Urutan posisi dari katoda ke anoda:

Lisin (dekat katoda), Alanin (tengah, tidak bergerak), Asam Glutamat (dekat anoda)

Karena selisih |pH - pI| untuk Lisin (|6,11 - 9,60| = 3,49) lebih besar dari Asam Glutamat (|6,11 - 3,15| = 2,96), Lisin memiliki muatan netto yang sedikit lebih besar dalam nilai absolut, sehingga umumnya bermigrasi lebih jauh.

(c) Alasan pemilihan pH 6,11:

Pada pH = pI Alanin = 6,11, Alanin menjadi spesi netral yang tidak bermigrasi, sedangkan Asam Glutamat (pI rendah) bermuatan negatif dan Lisin (pI tinggi) bermuatan positif. Ketiga asam amino terpisah ke tiga posisi yang berbeda dalam satu lajur elektroforesis. Ini adalah pemisahan sempurna dengan selisih muatan yang maksimal antara ketiganya.

---

Soal 2: Perhitungan pI

Suatu asam amino X memiliki data ionisasi sebagai berikut:

• pKa1 (gugus COOH) = 2,20
• pKa2 (gugus NH3+) = 8,90
• pKaR (gugus SH pada rantai samping) = 10,28

(a) Identifikasi asam amino X berdasarkan nilai pKa-nya.

(b) Gambarkan diagram ionisasi bertahap dari bentuk paling terprotonasi hingga paling terdeprotonasi.

(c) Hitung nilai pI asam amino X.

(d) Pada pH 9,59, hitunglah fraksi molar (dalam persentase) dari spesi yang bermuatan nol.

Pembahasan:

(a) Identifikasi: Berdasarkan pKa1 ~ 2,20, pKa2 ~ 8,90, dan pKaR ~ 10,28 (gugus SH), asam amino X adalah Sistein (data aktual: pKa1 = 1,92; pKa2 = 10,70; pKaR = 8,37, nilai dalam soal sedikit dimodifikasi untuk keperluan latihan. Pada soal ini gunakan nilai yang diberikan).

(b) Diagram ionisasi Sistein (dengan nilai pKa soal):

Urutan pelepasan proton (dari pKa terkecil ke terbesar):

1. pKa1 = 2,20: COOH → COO- (spesi kation H3A+ menjadi H2A0)
2. pKa2 = 8,90: NH3+ → NH2 (spesi H2A0 menjadi HA-)
3. pKaR = 10,28: SH → S- (spesi HA- menjadi A2-)

(c) Perhitungan pI:

Bentuk zwitterion Sistein adalah \(H_2A^0\) = COO-, NH3+, SH (muatan netto = -1 + 1 + 0 = 0). Zwitterion ini berada di antara spesi kation (H3A+, pKa1 = 2,20) dan spesi anion pertama (HA-, pKa2 = 8,90).

$$\text{pI} = \frac{\text{p}K_{a1} + \text{p}K_{a2}}{2} = \frac{2{,}20 + 8{,}90}{2} = \frac{11{,}10}{2} = 5{,}55$$

(d) Fraksi spesi netral pada pH 9,59:

Pada pH 9,59, kita gunakan Henderson-Hasselbalch. pH = 9,59 berada di antara pKa2 = 8,90 dan pKaR = 10,28, sehingga spesi dominan adalah HA- (COO-, NH3+, S-) dan H2A0 (COO-, NH3+, SH).

Fraksi H2A0 (spesi netral) dapat dihitung dengan mempertimbangkan dua kesetimbangan yang relevan:

Dari pKa2 = 8,90:

$$\frac{[\text{HA}^-]}{[\text{H}_2\text{A}^0]} = 10^{\text{pH} - \text{p}K_{a2}} = 10^{9{,}59 - 8{,}90} = 10^{0{,}69} = 4{,}90$$

Dari pKaR = 10,28:

$$\frac{[\text{A}^{2-}]}{[\text{HA}^-]} = 10^{\text{pH} - \text{p}K_{aR}} = 10^{9{,}59 - 10{,}28} = 10^{-0{,}69} = 0{,}204$$

Misal [H2A0] = 1. Maka [HA-] = 4,90. Dan [A2-] = 4,90 x 0,204 = 1,00. Spesi lain (H3A+ dan lebih terprotonasi) dapat diabaikan pada pH ini.

Total = 1 + 4,90 + 1,00 = 6,90

$$f_{H_2A^0} = \frac{1}{6{,}90} \times 100\% = 14{,}5\%$$

---

Soal 3: Analisis multikomponen

Dalam suatu eksperimen elektroforesis pada pH 5,00 menggunakan buffer asetat, empat noda (spot) teramati pada kertas setelah pewarnaan ninhidrin. Posisi noda-noda tersebut relatif terhadap titik awal adalah:

• Noda A: 3,2 cm ke arah katoda
• Noda B: 1,1 cm ke arah katoda
• Noda C: tidak bergerak (di titik awal)
• Noda D: 2,8 cm ke arah anoda

Empat asam amino yang dicampurkan adalah: Histidin (pI = 7,59), Alanin (pI = 6,11), Asam Aspartat (pI = 2,85), dan Glutamin (pI = 5,65). Tentukan korespondensi antara noda A, B, C, D dengan keempat asam amino tersebut beserta alasannya.

Pembahasan:

Analisis muatan netto setiap asam amino pada pH 5,00:

• Histidin (pI = 7,59): pH (5,00) << pI (7,59); selisih besar = muatan positif besar. Bermigrasi jauh ke katoda.
• Alanin (pI = 6,11): pH (5,00) < pI (6,11); selisih kecil = muatan positif kecil. Bermigrasi sedikit ke katoda.
• Glutamin (pI = 5,65): pH (5,00) < pI (5,65), tetapi selisihnya sangat kecil (0,65 unit). Muatan positif sangat kecil. Bermigrasi sangat sedikit ke katoda, namun dalam konteks soal ini, kita perlu membandingkan dengan alanin.
• Asam Aspartat (pI = 2,85): pH (5,00) >> pI (2,85); selisih besar = muatan negatif besar. Bermigrasi jauh ke anoda.

Perbandingan kuantitatif: pada pH 5,00, selisih |pH - pI| untuk setiap asam amino:

• Histidin: |5,00 - 7,59| = 2,59 (muatan positif, besar), Noda A (3,2 cm ke katoda)
• Alanin: |5,00 - 6,11| = 1,11 (muatan positif, sedang), Noda B (1,1 cm ke katoda)
• Glutamin: |5,00 - 5,65| = 0,65 (muatan positif, sangat kecil, namun masih positif). Bergerak sedikit ke katoda, tetapi berdasarkan data, Noda C tidak bergerak. Maka Glutamin paling mendekati pH 5,00 di antara empat asam amino, pI-nya 5,65 memang paling dekat ke pH 5,00 di antara semua asam amino yang positif. Namun Asam Aspartat (pI 2,85) yang bermuatan negatif justru bergerak ke anoda.

Dengan demikian, Noda C (tidak bergerak) bukan asam amino pada pI-nya, melainkan Glutamin yang pI-nya (5,65) paling dekat dengan pH eksperimen sehingga migrasinya sangat kecil, atau dalam kondisi eksperimental nyata, bisa tampak tidak bergerak secara signifikan bila resolusi tidak cukup tinggi. Secara ideal, Noda C = Glutamin.

Korespondensi akhir:

• Noda A (3,2 cm katoda) = Histidin: pI jauh di atas pH, muatan positif terbesar.
• Noda B (1,1 cm katoda) = Alanin: pI sedikit di atas pH, muatan positif kecil.
• Noda C (tidak bergerak) = Glutamin: pI sangat dekat dengan pH eksperimen, muatan netto mendekati nol.
• Noda D (2,8 cm anoda) = Asam Aspartat: pI jauh di bawah pH, muatan negatif besar.

---

Soal 4: Perhitungan kuantitatif

Asam amino X memiliki pKa1 = 2,35 dan pKa2 = 9,78 (mirip Glisin). Pada pH = pI, tentukan perbandingan konsentrasi zwitterion terhadap konsentrasi total semua spesi ionik asam amino tersebut (yaitu fraksi molar zwitterion, dalam persentase). Gunakan pKa1 = 2,35 dan pKa2 = 9,78.

Pembahasan:

Terlebih dahulu, hitung pI:

$$\text{pI} = \frac{2{,}35 + 9{,}78}{2} = 6{,}065$$

Pada pH = pI = 6,065, tiga spesi hadir: kation H2A+ (pKa1 = 2,35 mengeluarkannya), zwitterion HA (bentuk netral), dan anion A- (pKa2 = 9,78 mengeluarkannya).

Gunakan Henderson-Hasselbalch untuk menghitung rasio antar spesi:

$$\frac{[H_2A^+]}{[HA]} = 10^{\text{pKa}_1 - \text{pH}} = 10^{2{,}35 - 6{,}065} = 10^{-3{,}715} = 1{,}929 \times 10^{-4}$$ $$\frac{[A^-]}{[HA]} = 10^{\text{pH} - \text{pKa}_2} = 10^{6{,}065 - 9{,}78} = 10^{-3{,}715} = 1{,}929 \times 10^{-4}$$

Perhatikan: karena pH = pI = (pKa1 + pKa2)/2, kedua rasio identik, ini merupakan konsekuensi simetri dari definisi pI.

Misal [HA] = 1. Maka [H2A+] = [A-] = 1,929 x 10^-4.

Total konsentrasi = 1 + 2 x (1,929 x 10^-4) = 1 + 3,858 x 10^-4 = 1,0003858

$$f_{HA} = \frac{1}{1{,}0003858} \times 100\% = 99{,}96\%$$

Jadi, pada pH = pI, lebih dari 99,96% dari asam amino berada dalam bentuk zwitterion. Ini menunjukkan bahwa pada titik isoelektrik, hampir seluruh molekul berada dalam bentuk netral. Fakta ini penting dalam konteks elektroforesis: kontaminasi dari spesi bermuatan sangat minimal di titik isoelektriknya.

---

Soal 5: Isoelectric Focusing + Analisis IChO

Dalam teknik Isoelectric Focusing (IEF), gradien pH yang terbentuk berkisar dari pH 3 (sisi anoda) hingga pH 11 (sisi katoda) dengan panjang total medium 20 cm.

Campuran empat asam amino, Asam Aspartat (pI = 2,85), Sistein (pI = 5,07), Histidin (pI = 7,59), dan Arginin (pI = 10,76), diaplikasikan pada medium.

(a) Hitung posisi (dalam cm dari sisi anoda) di mana setiap asam amino akan terfokus, dengan asumsi gradien pH bersifat linear.

(b) Mengapa Asam Aspartat (pI = 2,85) tidak dapat difokuskan dalam sistem IEF dengan gradien pH 3-11 pada kondisi normal?

(c) Seorang peneliti menambahkan Glisin (pI = 6,07) ke campuran. Hitung jarak antara Glisin dan Histidin pada medium IEF. Diskusikan apakah kedua asam amino ini dapat terpisahkan dengan baik.

Pembahasan:

(a) Perhitungan posisi fokus:

Gradien pH = linear dari pH 3 (posisi 0 cm, sisi anoda) ke pH 11 (posisi 20 cm, sisi katoda). Gradien = (11 - 3)/20 = 0,4 unit pH per cm.

Posisi fokus (x, diukur dari sisi anoda) untuk asam amino dengan pI tertentu:

$$x = \frac{\text{pI} - 3}{0{,}4} \text{ cm}$$

• Asam Aspartat (pI = 2,85): x = (2,85 - 3)/0,4 = -0,375 cm (di luar gradien, tidak terfokus)
• Sistein (pI = 5,07): x = (5,07 - 3)/0,4 = 2,07/0,4 = 5,18 cm dari anoda
• Histidin (pI = 7,59): x = (7,59 - 3)/0,4 = 4,59/0,4 = 11,48 cm dari anoda
• Arginin (pI = 10,76): x = (10,76 - 3)/0,4 = 7,76/0,4 = 19,40 cm dari anoda

(b) Mengapa Asam Aspartat tidak terfokus:

pI Asam Aspartat = 2,85, yang berada di bawah batas minimum pH gradien (pH 3). Sebelum Asam Aspartat mencapai titik fokusnya (yang seharusnya ada di pH 2,85), ia akan keluar dari medium menuju elektroda anoda. Tidak ada titik dalam gradien pH 3-11 di mana muatan netto Asam Aspartat = 0; di seluruh panjang medium, Asam Aspartat bermuatan negatif dan terus bermigrasi ke arah anoda hingga keluar dari sistem.

(c) Jarak Glisin vs Histidin dan kualitas pemisahan:

Posisi Glisin (pI = 6,07): x = (6,07 - 3)/0,4 = 3,07/0,4 = 7,68 cm dari anoda

Posisi Histidin (pI = 7,59): x = 11,48 cm dari anoda (dihitung di atas)

Jarak antara Glisin dan Histidin = 11,48 - 7,68 = 3,80 cm

Pada panjang medium 20 cm, jarak 3,80 cm adalah sangat signifikan, keduanya akan terpisah dengan sangat baik. IEF memiliki resolusi yang dapat memisahkan asam amino dengan perbedaan pI hanya 0,01 unit, sehingga perbedaan pI sebesar 7,59 - 6,07 = 1,52 unit menghasilkan pemisahan yang sempurna.

---

11. Ringkasan Konsep Kunci

Konsep	Pernyataan Kunci
Zwitterion	Bentuk netral asam amino dalam larutan; memiliki NH3+ dan COO- sekaligus
pI	pH di mana muatan netto = 0; rata-rata dari dua pKa yang mengapit zwitterion
Migrasi dalam medan listrik	pH < pI: bermuatan (+), ke katoda; pH > pI: bermuatan (-), ke anoda
Laju migrasi	Berbanding lurus dengan |muatan netto| dan kuat medan, berbanding terbalik dengan ukuran dan viskositas
Pemilihan pH buffer	Pilih pH yang memaksimalkan perbedaan muatan antara asam amino target
IEF	Asam amino terfokus pada posisi gradien pH di mana pH = pI; resolusi sangat tinggi
Ninhidrin	Reagen visualisasi; asam amino primer menghasilkan ungu (570 nm), prolin menghasilkan kuning

---

Artikel ini disusun untuk keperluan persiapan OSN Kimia. Data pKa dan pI merujuk pada nilai standar suhu 25 derajat Celsius dalam larutan air.